生物3D打印肝细胞：核壳结构与成纤维细胞共培养以增强功能

为了了解和再现肝细胞在其生理微环境中的细胞相互作用并生成人工3D体外模型，开发了一种使用3D挤出生物打印的共培养系统。基于藻酸盐和甲基纤维素 (algMC) 的生物墨水首次被证明适用于肝细胞的生物打印；向algMC添加Matrigel可增强它们在单相支架中的增殖和形态。为了研究更复杂的细胞相互作用系统，我们应用核壳生物打印技术为肝细胞建立定制的3D共培养模型。

研究目的

建立基于3D核壳生物打印的概念，以algMC为基础生物墨水，在每个阶段提供稳定的核壳隔层支持被囊细胞的肝脏模型的生物构建。以HepG2(一种癌源性永生肝细胞系)为模型系统，我们开发了一种优化的墨水，以便更好地概括它们各自的生化微环境，从而支持细胞功能。这是通过将我们之前开发的algMC blend18与Matrigel进行功能化实现的。评估了所开发的墨水和核壳打印与HepG2细胞相结合的3D肝脏模型的适用性。作为组织复杂性方向的进一步发展，通过使用同轴挤压建立了成纤维细胞-HepG2共培养系统。在对打印的核壳构建物培养数周后，通过评估细胞形态和分布以及相关生物标志蛋白的表达来研究细胞与细胞之间的相互作用，以评估所开发的3D模型是否适合研究微环境对肝细胞的表型和性能的影响。

研究所用打印机及耗材

在无菌条件下使用GeSiM公司的BioScaffolder 3.1型号生物3D打印机制作支架。使用压缩空气通过锥形给药针(Nordson EFD, Germany)分配糊状生物墨水;在12个以空气为绘图介质的井板中，股线以一层一层的方式沉积，每层平行排列，层间方向偏移90°。

研究过程

HepG2在使用和不使用Matrigel的algMC打印结构中的活性

为了研究封装的HepG2的活性，生物打印和交联构建物培养了至少10天。在培养的不同时间点，用Calcein AM和EthD-1同时对支架内的活细胞和死细胞进行染色。

图1：使用和不使用Matrigel时，HepG2嵌入algMC的活力。(A)培养第2天、第7天和第10天嵌入打印支架的HepG2活/死染色的cLSM图像。活细胞被染成绿色(钙黄素)，而死细胞被染成红色(同型二聚体-1);比例尺= 250μm。(B)两种条件的存活率(存活集群与总集群的体积比)比较(n = 6，平均值±SD， ****p < 0.0001)。

使用和不使用Matrigel的algMC打印结构中HepG2的形态和组织

为了观察生物打印水凝胶支架内细胞的形态和组织，在培养的不同时间点对肌动蛋白细胞骨架和细胞核进行染色。

图2：培养2、7和10天后，HepG2嵌入有(上)和无基质(下)的algMC的形态和组织。细胞核染色为蓝色(DAPI)，细胞骨架显示为绿色(Phalloidin-iFluor 488染色肌动蛋白);比例尺代表50μm。

核壳生物打印系统中肝细胞-成纤维细胞间接共培养的空间定义模式

在确定合适的水凝胶材料支持肝细胞在三维环境下生长和功能后，我们旨在研究它们在由核壳3D生物图谱制作的复杂共培养系统中的性能。

           图3：肝细胞-成纤维细胞共培养概念的图示，显示被包裹在外壳中的肝细胞与核心的NIH 3T3成纤维细胞同轴打印，两者在各自的生物墨水中作为单细胞共打印(左)。假设核心成分(含或不含成纤维细胞和基质成分)对肝细胞表型的影响，因为它们可能在壳室中生长成簇，成纤维细胞在培养期间扩散形成网络( 右)。使用Biorender.com软件创建的图像。

制造载有细胞的核壳链支架

采用出口直径为800μm(壳)和400μm(芯)的同轴针制造核壳链。

图4：壳层用800μm针绘制，芯层用400μm针绘制。(A)无细胞的核壳链的立体显微图像，呈曲流状沉积，链内核(algMC)和壳(algMC+ Matrigel)分隔清晰;(B)无细胞的打印支架的立体显微图像，核心处有蓝色染色，用于通过同轴链可视化连续的核心室;插入物显示通过钢绞线段的截面，从脚手架刻度条上切割出2毫米。

图5：培养第7天的代谢活性(通过MTT染色;紫色)的HepG2和NIH 3T3细胞嵌入核壳打印水凝胶支架;核-壳界面通过c中的白色虚线可见，上面的图显示HepG2被包裹在由algMC+Matrigel组成的壳室中，而核仍然是游离细胞。下图显示NIH 3T3细胞被包裹在由algMC组成的核心腔室中，而外壳仍然没有细胞。(A,B)比例尺2 mm。(C)比例尺500µm。

在核壳链支架中同时嵌入HepG2和NIH 3T3细胞

为了在同时进行生物打印后对两种细胞类型进行可视化，首先用预先标记的细胞进行共培养实验。DiD标记的肝细胞（红色）被包裹在由algMC+Matrigel组成的外壳中，而DiI标记的成纤维细胞（蓝色）被包裹在由algMC组成的核心中。然后将这些支架与单一培养支架进行比较，后者只在外壳中有did标记的肝细胞，核心中没有细胞。

图6：核壳链支架中HepG2和NIH 3T3的空间分布。(A,B)支架中条带的荧光图像显示HepG2/NIH 3T3共培养与HepG2单培养支架中被包被细胞的分布;比例尺200μm。白色虚线表示整个链的宽度。(C)培养第4天核壳链共培养支架的荧光图像显示绿色的钙黄素染色活细胞;为了显示核心，覆盖青色通道(dii标记的NIH 3T3);比例尺1000μm。

图7：HepG2与NIH 3T3共培养及在核壳链支架中单独培养的活性及定位。共聚焦图像显示，已标记的HepG2(红色)被包裹在由algMC+基质组成的壳室中，NIH 3T3成纤维细胞被包裹在algMC核中，并用DiI(青色)标记(上图)或无细胞的algMC核(下图)。活细胞用Calcein-AM（绿色）染色。图显示了肝细胞在培养期间细胞簇形成的进展。比例尺(第1天)500μm;比例尺(第7、14天)300μm;白色虚线在这里表示核-壳接口。

核心生物墨水的功能化--增强成纤维细胞网络的形成

由于我们假设成纤维细胞的表型直接影响与肝细胞的相互作用，下一步是研究功能化生物墨水对NIH 3T3表型的影响。

图8：共培养第7天，成纤维细胞在核心室形成网络。核-壳水凝胶链共聚焦图像，在algMC+基质壳中包裹有did标记的HepG2(红色)，在algMC核中嵌有dii标记的NIH 3T3成纤维细胞(青色)，algMC补充了纤维蛋白，algMC补充了血浆。活细胞被Calcein AM染成绿色，表明纤维蛋白和血浆功能化核心内形成了成纤维细胞网络，而未修饰的algMC核心中保持成纤维细胞的圆形形态。上面的瓦片给出了核壳链的一个部分的概述;放大倍率5倍，比例尺500μm。下图显示核心的NIH 3T3成纤维细胞放大倍数(10倍)图像;比例尺400μm。

微环境对核壳生物打印共培养系统中肝脏标记蛋白表达的影响

肝细胞的功能通常通过其合成和分泌特定蛋白质的能力来评估。因此，为了研究在不同核心材料中生长的成纤维细胞对邻近壳室肝细胞的影响，我们通过抗体染色和随后的免疫荧光显微镜观察不同条件下特异性标记蛋白的表达。

图9：单核细胞培养中(无细胞的algMC核;I)和NIH 3T3成纤维细胞共培养嵌入不同成分的核心室(II-IV)。(A) HepG2蛋白(紫色)、细胞核(蓝色)和细胞骨架(绿色)染色共聚焦图像;比例尺50μm。(B) HepG2的CK-19(黄色)、细胞核(蓝色)和细胞骨架(红色)染色共聚焦图像;比例尺50μm。(C) HepG2的AAT(绿色)、细胞核(蓝色)和细胞骨架(红色)染色共聚焦图像;比例尺50μm。

开发的水凝胶系统的流变学和机械性能

为了进一步表征改性水凝胶共混物的打印后和交联性能，我们对单相支架进行了单轴压缩试验，以研究三维结构在绘图和后处理后的机械稳定性和刚度。

图9：打印和交联后单相和核壳链支架的机械特性。( A )交联单相支架在第1天的应力-应变曲线。( B ) 交联的单气态脚手架在第1天的压缩模量。( C ) 交联的核壳支架在第1天时的应力-应变曲线，其核心成分algMC+Matrigel 壳中是不同的。( D ) 交联核壳支架在第1天的压缩模量（n = 4，p*** < 0.0005，平均值±SD）。

为了构建肝组织模型，以核-壳方式共培养成纤维细胞是了解这种共培养生物打印策略的巨大潜力的第一步。为了开发体外肝脏模型，开发与其他细胞类型的共培养系统将是我们未来工作的目标，在此演示如何使用核-壳技术使我们能够为生物打印细胞设计定制的3D微环境。为了模拟由血管和相互连接的血管组成的生理肝脏结构，下一步将进一步增加开发用于肝细胞与内皮细胞和其他支持细胞类型共培养的打印结构的复杂性。这将使我们能够研究这些3D系统中的细胞相互作用，并建立可灌注的肝脏模型。

图10：肝细胞共培养概念的图形表示，显示了体内的肝小叶是如何由血管、导管和管道（脉管）组成的，如上图所示，这些血管、导管和管道被肝细胞片所包围。因此，模拟肝小叶微结构的概念被设想为打印在外壳上的肝细胞和排列在可灌注结构核心的内皮细胞的共培养模型(下图)。中间插图来自 Cornell, B. 2016。肝小叶。

研究结论

研究中我们提出了基于3D挤压的生物打印作为一种有前途的工具来生成具有生物活性的肝组织模型。通过对生物墨水成分的特定适应，以及以核壳方式应用两种不同生物墨水的同轴打印，可以控制和调节肝细胞的3D微环境，以模拟特定的条件。我们采用核壳链/支架设计，建立了肝细胞和成纤维细胞的功能共培养模型。通过比较不同的墨水成分(含或不含生物活性成分的algMC)以及共培养与单培养，我们可以在我们的概念验证研究中展示空间定义的3D微环境的变化成分对肝细胞增殖和所选肝细胞特异性标记物表达水平的强烈影响。这些发现强调了定制3D微环境以生成人工肝脏结构的重要性，以及为此目的的多功能生物打印技术的巨大潜力。需要论文全文的可以联系我们获取，谢谢！